PEWARNAAN TAHAN ASAM

Tujuan:

    1)      Mempelajari dasar kimia pewarna tahan asam

   2)      Mempelajari prosedur untuk membedakan bakteri menjadi kelompok tahan asam dan tak tahan asam (gambar 9).

Prinsip

            Beberapa golongan bakteri tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan sederhana dan gram seperti bakteri golongan Mycobacteruim seperti M. tubercolosis dan M. leprae yang hanya dapat terwarnai oleh pewarnaan tahan asam.

            Hal ini disebabkan karena adanya dinding yang mengandung lilin ( waxy atau lipoidal) tebal yang menyebabkan penetrasi warna sangat sukar. Selain itu warna yang telah terserap sangat sulit untuk dilarutkan sehingga memerlukan alcohol asam sebagai bahan pelarut.

Pada pewarnaan ini menggunakan 3 macam raegen :

    1)      Pewarnaan primer: karbol fuchsin merupakan pewarna fenolik yang larut dalam bahan lipoidal , penyusun utama dinding sel bakteri sehingga terjadi penetrasi dan retensi warna merah . penetrasi lebih lanjut dengan pemanasan sehingga karbol fuchsin melewati dinding sel dan masuk kedalam sioplasma. Jika karbol fuchsin ditambah Turgitol (‘wetting agent’) yang dapat mereduksi tegangan permukaan antara dinding sel mikobakteri dengan pewarna. Setelah sel diberi dengan pewarna primer sel tampak merah.

   2)      Bhan pelarut: alcohol asam (3% HCL + 95% etil alcohol).  Sel bakteri tahan asam warna merah dari pewarna primer tidak larut karena daya larut pewarna primer lebih besar daripada dalam alkohol asam. Setelah tahapan ini bakteri tahan asam berwarna merah sedangkan bakteri tak tahan asam tidak berwarna. 

     3)      Pewarnaan kontras: Methylen blue

Bakteri tahan asam + : terwarna merah

Bakteri tahan asam - : terwarna biru

BAHAN

·         Kultur

            Kultur kaldu trypticase Myobacterium smegmati dan S. aureus berumur 24 jam

·         Reagen

            Karbol fuchsin dan metilen biru

·         Peralatan

Lampu Bunsen, hotplate, jarum inokulasi ujung bulat, kaca objek, kertas hisap, kertas lensa, baki pewarnaan dan mikroskop.

PROSEDUR:

    1)      Bersihkan ketiga kaca objek

    2)      Dengan menggunakan teknik steril, siapkan apusan bakteri setiap organisme ditambah ketiga campuran M. smegmatis dan S. aureus

    3)      Biarkan apusan mengering diudara dan fiksasi panas

    4)      Aliri apusan dengan karbol fuchsin dan letakkan pada hotplate hangat, biarkan diatas penangas selama 5 menit. Perhatian : jangan biarkan pewarna menguap, jadi teteskan pewarna terus-menerus. Untuk metode tanpa pemanasan, aliri apusan dengan karbol fuchsin yang mengandung turbitol selama 3-5 menit.

    5)      Cuci dengan air keran. Preparat yang dipanaskan harus didinginkan sebelum dicuci.

    6)      Dekolarisasi dengan asam alkohol , tambhakan reagen setetes demi setetes sehingga karbol fuchsin tidak tercuci lagi.

    7)      Teteskan pewarna kontras metilen biru selama 2 menit.

    8)      Cuci apusan dengan air keran .

    9)      Keringkan dengan kertas hisap dan amati dibawah mikroskop.

   10)  Buat gambar setiap preparat dengan perbesaran yang sesuai untuk dapat melihat bentuk, ukuran sel cukup jelas.

   11)  Perhatikan warna sel yang terwarnai, golongkan bak apakah termasuk kelompok tahan asam atau non tahan asam.