PEWARNAAN GRAM

Tujuan:

1)      Mengetahui dasar-dasar kimia dan teori prosedur pewarnaan diferensial

2)      Mengetahui dasar kimia pewarna gram

3)      Mengetahui prosedur untuk membedakan bakteri menjadi 2 golongan utama: gram positif dan gram negative (gambar 8)

Prinsip

Pewarnaan diferensial yang menggunakan paling sedikit 3 reagen pewarna setelah apusan bakteri  difiksasi panas.

Reagen pertama adalah:

1)      Pewarna primer

Berfungsi sebagai mewarnai seluruh sel

2)      Bahan dekolorisasi

Berfungsi untuk menstabilkan pewarna kontras dengan cara melunturkan pewarna primer dari semua sel atau dari struktur sel tertentu.

3)      Pewarna kontras

Merupakan pewarna kontras terhadap pewarna primer.  Setelah dekolorisasi jika pewarna primer  tidak  tercuci oleh bahan dekolorisasi, maka pewarna kontras tidak dapat diabsorpsi  oleh sel dan sel akan tetap terwarnai oleh warna primer. Jika pewarna  primer tercuci maka sel sel terwarnai oleh pewarna kontras Pewarna ini pertamakali ditemukan oleh Dr. Christian Gram yang menggolongkan bakteri  menjadi  bakteri gram positif dan gram negative. Tujuan pewarnaan ini adalah untuk klasifikasi dan diferensiasi bakteri.

Pewaranaan gram menggunakan  4 macam reagen pewarna:

1)      Pewarna primer, Kristal violet

Pewarna ini akan mewarnai seluruh sel bakteri menjadi biru ungu.

2)      Mordan, gram iodine

Pewarna ini akan berikatan dengan pewarna primer membentuk kompleks Kristal violet –iodin tidak dapat larut. Kompleks Kristal violet-iodin menyebabkan pewarna lebih intensif meresap pada sel sehingga semua sel terlihat hitam ungu. Pada bakteri gram  + kompleks ini akan berikatan dengan magnesium asam ribonukleat komponen dinding sel, sehingga kompleks sulit dihilangkan oleh bahan dekolorisasi.

3)      Bahan dekolorisasi, etil alcohol 95%

Berfungsi sebagai pelarut lemah dan bahan penghidrasi protein. Kerjanya mendeterminasi  konsentrasi lipid  dinding sel bakteri. Pada sel bakteri gram +, kandungan lemak sel yang rendah berfungsi menghamabat pembentukan kompleks Mg-RNA,  sehingga lemak yang larut  menyebabkan pori-pori kecil pada dinding sel, kemudian ditutup oleh efek dehidrasi protein. Akibatnya terjadi ikatan sangat kuat antara pewarna primer  yang sangat sukar dihilangkan, sehingga sel bakteri gram + terwarna biru. Pada sel  bakteri gram -, konsentrasi lipid lebih banyak pada bagian luar dinding sel. Pada waktu terjadi dehidrasi protein oleh alcohol dan lemak larut akan menimbulkan pori yang lebih besar  karena lemak yang terlarut lebih banyak. Sehingga kompleks Kristal violet-iodin yang tidak terikat mudah dilepaskan, akibatnya sel bakteri gram-tidak terwarna.

4)       Pewarna kontras, safranin

Merupakan reagen akhir untuk mewarnai sel bakteri  Gram  - yang telah mengalami deklorisasi , sehingga hanya sel Gram – yang dapat mengabsorpsi  warna pewarna kontras  sehingga sel terwarna merah. Sedangkan sel bakteri Gram + tidak bisa mengabsorpsi dan tetap terwarna biru oleh pewarna primer.

Beberapa hal yang perlu diperhatikan pada pewarnaan gram yaitu:

1)      Tahapan yang paling penting adalah pada waktu fase pelunturan yaitu kompleks CV-I dilepaskan dari sel  oleh bahan pelarut (‘decolorizing agent’). Jika pelarutan berlebih maka pewarna primer hilang sehingga bakteri gram + akan terlihat sebagai gram -. Sebaliknya jika pelarutan kurang, kompleks CV-I tidak larut semua maka bakteri gram – terlihat sebagai gram +.

2)      Kaca obyek harus selalu dicuci dalam air kran mengalir diantara penambahan pewarna untuk menghilangkan kelebihan warna dan mempersiapkan pewarna berikutnya.

3)      Kultur bakteri harus segar, kurang dari 24 jam karena jika biakan terlalu tua bakteri gram + kehilangan kemampuan untuk menahan pewarna primer sehingga dihasilkan bakteri gram campuran yaitu beberapa sel terwarna  biru dan sel yang lain terwarna merah.

BAHAN

Kultur

Kultur E.coli, S. aureus dan B. cereus dalam medium agar nutrisi miring berumur 24 jam.

Reagen

Kristal violet, gram iodine, alcohol 95% dan safranin

Peralatan

Lampu Bunsen, jarum inokulasi, baki pewarnaan, kaca objek, kertas lensa dan mikiroskop

PROSEDUR

1)      Bersihkan empat kaca objek

2)      Dengan menggunakan teknik steril, siapkan apusan masing-masing dari ketiga bakteri dan pada kaca objek sisa dibuat apusan yang terdiri dari campuran S. aureus dan E. coli. Ini dilakukan dengan meneteskan air pada kaca objek  dan ditransfer setiap organism secara terpisah ke tetesan air pada kaca objek dan di transfer  setiap organism secara terpisah ke tetesan air pada kaca objek dengan jarum inokulasi yang telah disterilkan dan didinginkan. Kedua organism kemudian dicampur dan disebarkan dengan gerakan memutar dengan jarum inokulasi.

3)      Biarkan apusan mengering di udara, kemudian fiksasi panas dengan cara seperti biasa.

4)      Aliri dengan Kristal violet dan diamkan selama 1 menit

5)      Cui dengan air keran

6)      Aliri apusan mordan Gram iodine dan biarkan selama 1menit

7)      Dekolorisasi dengan alcohol 95%. Perhatikan jangan over dekolorisasi. Tambahkan reagen setetes demi setetes hingga Kristal violet tidak tercuci lagi dari apusan.

8)      Cuci dengan air keran

9)      Beri pewarna kontras dengan safranin selama 45 detik.

10)  Cuci dengan air keran

11)  Keringkan diantara kertas saring , amati dibawah mikroskop

12)  Buat gambar hasil pengamatan bedakan atas morfologi dan susunannya, amati warna sel terwarnai.